專家講解新型冠狀病毒的檢測
撰文 | 王萍
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現在有哪些檢測新型冠狀病毒的方法？
檢測傳染病的策略通常有兩種：檢測病原體本身，或檢測人體為了抵抗病原體而產生的抗體。檢測病原體既可以檢測抗原?（一般是病原體表面蛋白，有些用內部核蛋白），也可以檢測核酸。如果病人的體液中檢測到抗體、抗原或核酸三者中的任何一種，則意味著已被感染。由于抗體產生需要時間，一般幾天至幾周不等，有些免疫功能較弱的病人可能抗體量很低，容易造成假陰性（已經感染，但是測試結果看起來沒有被感染）。而在感染之初，病原體抗原含量也較低，同樣不容易檢測到。所以，目前廣泛采用的是檢測病原體的核酸序列， 通過擴增反應來放大信號， 檢測的靈敏度高、特異性好。
早在1月11日，新型冠狀病毒的全基因序列就已發(fā)布（由上海市公共衛(wèi)生臨床中心和公共衛(wèi)生學院、華中科技大學武漢中心醫(yī)院、武漢市疾控中心、中國疾控中心傳染病預防控制所聯(lián)合澳大利亞悉尼大學聯(lián)合完成），國內和國際多個廠家和機構都迅速跟進，開發(fā)檢測試劑盒。檢測試劑盒可以一次性檢測幾百個樣本，而在開發(fā)出檢測試劑盒之前，一般只能通過RNA測序方法檢測病毒，速度會很慢。
新型冠狀病毒和SARS病毒的高度同源性對試劑盒設計也有幫助。由于新型冠狀病毒是RNA病毒，試劑盒檢測基本都采用反轉錄加實時聚合酶鏈式反應法（RT-PCR），擴增病原體的核酸 (RNA) ，同時通過熒光探針實時檢測擴增產物。這種方法很靈敏，也能夠很好地定量。世界衛(wèi)生組織（WHO）網站上列有德國、香港、泰國、日本和中國疾控中心所使用的檢測方法和引物序列，基本都是針對病毒序列中高度保守的2至3個序列——比如編碼replicase（復制酶）或者necleocapsid（核蛋白衣，核鞘）的核酸序列——來進行檢測。但是各個方法用的序列都不完全相同。一些方法使用multiplex，也就是把多個目標序列在同一反應管中擴增；另一些采用分步，先用一個目標序列篩查，陽性后再用另一個序列確認。檢測反應的準確程度取決于公布的基因序列的準確程度，以及引物、探針等的設計。從目前公布的有限數據來看，這些試劑盒的準確率都不錯。由于現在能檢測的病人都是臨床高度疑似，所以陽性預測值非常高。
也正是因為這個新型冠狀病毒和SARS的相似性很高，如果感染的是SARS病毒，結果也會是陽性的。
當然，也可用測序方法更準確的確認新型冠狀病毒， 但是對儀器要求高，速度也慢一些，不適合大批量篩查。
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為什么要multiplex多重反應？為什么要用多個目標序列？
作為篩查手段，要求是快速和高靈敏度。每個RT-PCR反應需要2小時左右出結果，multiplex也就是多個檢測平行同步進行，可以有效縮短整個流程時間，加快檢測速度。另外病毒變異很快，用多個保守目標序列可以防止病毒變異產生假陰性。
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采樣以后，多久能拿到結果？
如果就近在同一個醫(yī)院可以馬上檢測的話，2-3小時就應該可以看到結果，但是當地如果感染控制或儀器人員條件不夠 （見下個問題），就需要把樣本送到區(qū)域甚至全國檢測中心（比如疾控中心），加上運輸時間，可能需要上24小時甚至幾天。
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使用檢測試劑盒有什么要求？為什么不是每個醫(yī)院都做？
對新型冠狀病毒這樣的疾病來說，檢測所用的血液或其他體液可能具有高傳染性，檢測和離心過程中產生的氣溶膠可能感染檢測人員，所以對檢測實驗室在感染控制方面有很高要求。SARS病毒要求三級生物安全水平（BSL level 3），埃博拉病毒（Ebola）要求四級生物安全水平（ BSL level 4），必須考慮通風、氣壓、樣本流向（指樣本從病房通過什么途徑到檢驗實驗室，從哪個門進入，到達實驗臺后從哪個儀器到哪個儀器，廢棄樣本怎么處理，從哪個門出實驗室等系列流程）等方面（見圖2），檢測人員也要經過特殊訓練。從儀器上來說，至少要有離心機、核酸提取儀器、實時聚合酶鏈式反應儀器等。所以不是每家醫(yī)院都有條件做檢測。
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試劑盒短缺，來不及檢測怎么辦？
試劑盒短缺影響確診人數的統(tǒng)計，但對臨床治療影響不大， 因為迄今還沒有針對新型冠狀病毒的特效藥， 臨床上根據病人表現，CT（計算機斷層成像）看到肺部典型病變，就可以隔離并開始治療，治療也以提供病人生命支持為主，沒有必要等待檢測結果確診。如前所述，在疾病高度疑似人群中用一個性能不錯的檢測試劑去測，由于患病率 （disease prevalence）高，測出的陽性結果有很大可能是真陽性 （positive predictive value陽性預測值高）， 而反之測出的如果是陰性結果，是真陰性的可能性不大 （negative predictive value陰性預測值低），所以試劑盒檢測結果基本是起確認臨床診斷的作用。
作者簡介
王萍，湖北仙桃人，現于賓西法尼亞大學病理檢驗系任教，任賓西法尼亞大學醫(yī)院臨床化學及中心實驗室主任，致力于臨床疾病檢測，研發(fā)和產業(yè)轉化最新的疾病診斷預后方法。
補充＆提問：
1、試劑盒的檢測依據是病毒的保守序列，如果一個染病的人痊愈了，身體有抗體了，過后病毒變異了，他會不會因為已經有抗體就不會中招？就像試劑盒能識別出病毒一樣，人體T細胞也能識別出這個變異了的病毒，從而保護人體？
回答：這要看抗體識別的抗原在病毒上是否有變異，如果變異了，原來的抗體就不再能識別這一抗原了。這也是每年的流感疫苗并不能完全防止得流感的原因——因為打進去的疫苗產生的抗體識別不了新的變異流感病毒。
2、請問檢測過程中產生的氣溶膠指的是核酸嗎，是否主要包括DNA？氣溶膠感染人的主要途徑又是什么？
回答：檢測過程中產生的氣溶膠指的是樣本和試劑液滴在空氣中的懸浮顆粒。如果樣本包含病毒，這些氣溶膠可能包含病毒顆粒，直接通過呼吸道吸入而感染人，或附著在衣物、皮膚上，最終仍然進入呼吸道。如果防控措施不到位，檢測甚至會擴大污染范圍。另外操作不規(guī)范的話，氣溶膠也可能污染別的樣本甚至實驗室，導致假陽性結果的產生。
3、熒光探針檢測RNA是什么原理？
回答：RNA 先通過反轉錄成為 DNA，然后通過鏈式反應擴增，后面步驟有多種可能性，可以直接用熒光染料和擴增的DNA結合，也可以通過熒光共振能量轉移的原理，擴增過程中擠掉抑制探針，讓原來被抑制的熒光探針熒光增強。用達到最強熒光一半值的擴增循環(huán)數目大小來判定起始RNA的多少。
4、如果人體接觸了該病毒的RNA而非完整病毒，RNA是否會在人體內復制并重組成完整病毒？
回答：從現在知道的病理機制來看，病毒需要表面蛋白結合人體細胞表面受體才能進入人體細胞，如果只有RNA的話應該無法進入。
5、據說國內確診需要做兩次試劑盒檢測，一次陽性為疑似，兩次陽性為確診。請問這是為了分步檢測不同序列嗎？還是單純的重復實驗排除假陽性？
回答：我確實聽說要做兩次，甚至有要求做三次的，其實在高度疑似人群中，真陽性的可能性非常高，除非對操作流程或試劑有疑問，否則沒有必要重復。
6、在試劑盒不足的情況下，疑似的患者該怎么辦？另外，普通肺炎患者和新型冠狀病毒的肺炎患者在CT影像上是否很好區(qū)分？
回答：疑似的患者應該隔離，不管在家還是在醫(yī)院。醫(yī)院床位不夠的情況下應該在家隔離，出現了呼吸癥狀應該去醫(yī)院治療。我不是放射科醫(yī)生，但是根據各種放射醫(yī)學文獻來看，不同種病毒引起的肺部影像變化有相似之處，也各有獨特特征，有經驗的放射科醫(yī)生可以識別。
7、試劑盒檢測結果并不能100%準確，那么符合流行病史并出現臨床表現的患者 (疑似患者) 就應該和確診患者一樣立即開始治療嗎？
回答：對于高度疑似傳染性疾病來說是這樣的，隔離應先于確診，有臨床表現就應該開始對癥治療，而且在檢測結果出來前，防感染措施要到位，要當作假定結果是陽性來處理。當然，這都是在假定資源充足的情況下。
8、為什么說試劑盒短缺影響確診人數的統(tǒng)計，但對臨床治療影響不大？
回答：見前一個問題的回答，有條件隔離就應該隔離，有癥狀就針對癥狀治療，沒有必要等檢測結果確定，即使后來檢測結果陰性，隔離也可降低交叉感染機會。檢測方面，個人認為，在檢測實驗室質量控制過關的情況下，除非對檢測過程中操作流程或試劑有疑問，否則沒有必要重復檢測。重復檢測會導致需要的時間延長，消耗的試劑增加，失去篩查的快速優(yōu)勢。我目前還沒有看到發(fā)布的檢測結果，如果將來能公布的話，我們應該能看到有多少病例是第一次陽性，第二次或第三次沒有確認為陽性的，在目前這種情況下應該很少。
