例如我們的闌尾，是一個(gè)由于人類飲食結(jié)構(gòu)變化而在演化過程中逐漸退化的器官，甚至得了闌尾炎還很痛，那人類基因組中98.5%的非編碼序列，也是如此嗎？近年來，對于lncRNA（即長度大于200個(gè)核苷酸且不編碼蛋白質(zhì)的RNA）的生物學(xué)功能研究已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)，并且有越來越多的研究表明，lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控過程中具有的重要地位。lncRNA的合成主要通過RNA聚合酶II（Pol II）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，其5'端與7-甲基鳥苷（m7G）結(jié)合，在3'端則發(fā)生多聚腺苷酸化，同時(shí)也經(jīng)歷與mRNA相似的剪接過程。

一、lncRNA的功能

lncRNA可以與DNA、RNA、蛋白質(zhì)等多種分子相互作用，調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)和功能；或者順式或反式調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，影響mRNA的剪接、穩(wěn)定和翻譯等，如下圖所示：

圖1 細(xì)胞內(nèi)lncRNA的作用

已知的幾種lncRNA的作用機(jī)制：1、對于某些lncRNA，上游啟動(dòng)子（橙色）轉(zhuǎn)錄方向是雙向的，其中一個(gè)方向相對容易被降解。2、通過抑制RNA聚合酶II的募集或誘導(dǎo)染色質(zhì)重塑，對下游基因表達(dá)（藍(lán)色）產(chǎn)生影響。3、反向轉(zhuǎn)錄（紫色）與正向轉(zhuǎn)錄（藍(lán)色）結(jié)合，阻斷剪接體對剪接位點(diǎn)的識(shí)別，形成選擇性剪接轉(zhuǎn)錄。4、反向轉(zhuǎn)錄（紫色）與正向轉(zhuǎn)錄（藍(lán)色）結(jié)合，通過Dicer產(chǎn)生內(nèi)源性siRNA。5、結(jié)合特定的蛋白質(zhì)伴侶，非編碼轉(zhuǎn)錄（綠色）調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性。6、作為結(jié)構(gòu)成分，有助于形成更大的RNA蛋白質(zhì)復(fù)合物。7、影響蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位。8、經(jīng)過加工作用，生成各類小RNA。

二、lncRNA的研究思路

lncRNA的研究大致可以分為幾個(gè)步驟，如下圖所示：

圖2 lncRNA一般研究策略

1、目標(biāo)lncRNA篩選

A、通過訪問公共數(shù)據(jù)庫，例如Ensemble、NCBI、LNCipedia等，可以篩選并獲取已知的lncRNA信息，包括其基因序列、表達(dá)譜和功能注釋等。

B、利用公共數(shù)據(jù)庫中的高通量測序數(shù)據(jù)，例如RNA-Seq數(shù)據(jù)，可以鑒定不同組織或疾病狀態(tài)下的差異表達(dá)基因，從中篩選出顯著差異表達(dá)的lncRNA作為潛在目標(biāo)。

C、查閱已發(fā)表的文獻(xiàn)，特別是與研究領(lǐng)域相關(guān)的一些研究，尋找已經(jīng)報(bào)道的lncRNA。

2、確定差異lncRNA特征

A、通過使用5'和3' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技術(shù)，利用3′RACE獲得3′端序列（基因特異性引物→3′末端），利用5′RACE獲得5′端序列（基因特異性引物→5′末端），進(jìn)而推斷l(xiāng)ncRNA的全長序列。此外，使用全長cDNA克隆和測序也是一種獲得lncRNA全長序列的方法。

B、可以使用RNA-FISH原位雜交技術(shù)對目標(biāo)lncRNA的亞細(xì)胞定位進(jìn)行準(zhǔn)確定位。另外，可以使用細(xì)胞核/質(zhì)分離試劑盒來分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，并從分離后的細(xì)胞組分中提取RNA。隨后，利用qRT-PCR技術(shù)對目標(biāo)lncRNA進(jìn)行檢測，以確定其在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的分布。

C、利用qRT-PCR檢測lncRNA在不同細(xì)胞或者組織中的表達(dá)水平。

3、lncRNA功能研究中常用的調(diào)控手段

通過多種實(shí)驗(yàn)手段和技術(shù)方法，進(jìn)行l(wèi)ncRNA功能性研究，包括RNA干擾、基因敲除、過表達(dá)等實(shí)驗(yàn)，從而驗(yàn)證目標(biāo)lncRNA在特定細(xì)胞過程或疾病中的功能。

A、RNA干擾（RNA interference）: 使用小干擾RNA (siRNA) 來沉默lncRNA的表達(dá)，其原理是細(xì)胞質(zhì)定位的lncRNA由RNA-RNA形成的二元復(fù)合物以RISC的形式被Dicer酶降解。對于細(xì)胞核中的lncRNA來說，ASO（15～25個(gè)核苷酸的化學(xué)修飾短鏈核酸）可與之形成DNA-RNA復(fù)合物被RNase H分解（可以特異性地水解DNA-RNA雜合鏈中的RNA）。

B、過表達(dá)（Overexpression）: 將lncRNA基因過表達(dá)到相對較高的水平，可通過觀察細(xì)胞表型的變化，可以進(jìn)一步驗(yàn)證和探究lncRNA的功能。

C、基因敲除（Gene knockout）: 利用CRISPR/Cas9技術(shù)直接敲除lncRNA基因，進(jìn)一步研究lncRNA在細(xì)胞/體內(nèi)的功能。通過比較敲除細(xì)胞/動(dòng)物和野生型細(xì)胞/動(dòng)物之間的表型差異，可以深入了解lncRNA在生理、發(fā)育和疾病過程中發(fā)揮的重要調(diào)節(jié)作用。

4、lncRNA機(jī)制研究

為了進(jìn)一步研究和解析目標(biāo)lncRNA的作用機(jī)制，可以使用多種技術(shù)，如ChIRP、RIP、ChIP-seq、雙熒光素酶、RNA pull-down等。接下來，我們將介紹其中一些技術(shù)。

A、lncRNA與DNA的相互作用

使用CHIRP（Chromatin isolation by RNA purifications）技術(shù)，可以在活細(xì)胞狀態(tài)下形成lncRNA-染色質(zhì)復(fù)合物，并通過超聲打斷染色質(zhì)。然后，使用生物素標(biāo)記的探針與lncRNA分子雜交，利用親和素磁珠純化lncRNA及其結(jié)合的染色質(zhì)片段。最后，通過WB、質(zhì)譜等方法進(jìn)行結(jié)果分析，如圖3所示[2]。? ? ? ? ? ? ? ? ?

圖3 ChIRP實(shí)驗(yàn)原理?

B、lncRNA與miRNA的相互作用

通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)，可以構(gòu)建lncRNA基因報(bào)告基因載體，并與miRNA mimics共轉(zhuǎn)染至293T工具細(xì)胞中，以驗(yàn)證lncRNA與miRNA之間的相互作用。通過監(jiān)測熒光素酶活性的變化來間接評估lncRNA與miRNA之間的結(jié)合程度及其調(diào)節(jié)效應(yīng)。

C、lncRNA與蛋白質(zhì)的相互作用

可以使用RNA-Pull down技術(shù)進(jìn)行檢測。通過生物素特異標(biāo)記的lncRNA探針與細(xì)胞質(zhì)蛋白提取液進(jìn)行聯(lián)合孵育，形成lncRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可以與鏈親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)分離效果。隨后，對復(fù)合物進(jìn)行洗脫純化，并通過Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與lncRNA相互作用，如圖4所示[3]。

圖4 RNA-pull down實(shí)驗(yàn)原理

參考文獻(xiàn)：

1、Wilusz, Jeremy E et al. “Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world.”?Genes & development?vol. 23,13 (2009): 1494-504. doi:10.1101/gad.1800909

2、Chu, Ci et al. “Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.”?Cell?vol. 161,2 (2015): 404-16. doi:10.1016/j.cell.2015.03.025

3、Chu, Ci et al. “Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.”?Cell?vol. 161,2 (2015): 404-16. doi:10.1016/j.cell.2015.03.025