基因編輯細菌

?Red/ET重組系統(tǒng)是微生物基因編輯最經(jīng)典的方法，可以實現(xiàn)對DNA分子的敲除、點突變、敲入等多種修飾。該技術(shù)已被廣泛地用于基因組DNA，如細菌人工染色體、大腸桿菌染色體等的遺傳修飾研究以及基因工程藥物的研究和開發(fā)中。但如何提高基因重組和編輯效率，一直是微生物基因編輯的研究熱點，直到CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，給微生物基因編輯帶來一線曙光。

CRISPR/Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。近些年，由于CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)操作簡單，基因編輯效率高被廣泛應用，是目前用于基因編輯最前沿的方法。

CRISPR-B?是源井生物在基于Red/ET重組系統(tǒng)和CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)基礎上，通過自主研發(fā)優(yōu)化基因編輯載體和基因編輯流程，在基因編輯效率和準確性均遠高于傳統(tǒng)方法的一項創(chuàng)新性技術(shù)。該技術(shù)可以廣泛應用于細菌和真菌的基因編輯。

CRISPR-B?技術(shù)優(yōu)勢

基因編輯細菌

基因編輯細菌：源井生物利用CRISPR-B?技術(shù)通過電轉(zhuǎn)的方法將CRISPR-B?系列載體導入細菌中，對細菌進行基因編輯，可實現(xiàn)細菌的敲除，點突變或敲入。

傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)存在后期篩選工作量大（周期），重組效率低，殘留loxP或FRT位點等缺點。CRISPR-B?技術(shù)作為一種高效的基因組編輯技術(shù)，具有操作簡單、靶向性強、脫靶率低、無痕等諸多優(yōu)勢。

CRISPR-B?技術(shù)可編輯的細菌（節(jié)選）：

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技術(shù)流程

1. 構(gòu)建 CRISPR-B?細菌系列載體

2. 電轉(zhuǎn)及制備穩(wěn)轉(zhuǎn)CRISPR-B _CR的感受態(tài)

·CRISPR-B _CR電轉(zhuǎn)到細菌中，菌落PCR鑒定CRISPR-B _CR是否成功轉(zhuǎn)入。

·并將成功轉(zhuǎn)入CRISPR-B _CR的菌株再制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞。

3. 導入CRISPR-B_G及CRISPR-B _D進行打靶

將打靶載體CRISPR-B_G及CRISPR-B _D修復模板電轉(zhuǎn)進穩(wěn)轉(zhuǎn)CRISPR-B _CR的感受態(tài)菌株中，CRISPR系統(tǒng)與Red重組系統(tǒng)共同作用對細菌基因組進行編輯。

4. 挑取單克隆進行PCR及測序鑒定，將CRISPR-B?質(zhì)粒消去，獲得敲除陽性克隆菌株。

質(zhì)量控制標準

1. 菌落PCR鑒定 ??? 2.靶位點測序鑒定

注明 | 文章是源井生物原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請注明。

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